EndoFree Plasmid Midi Kit
无内毒素质粒中提试剂盒(5-15mL)
¥298.00
CW2105S
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本产品采用独特的硅基质膜吸附技术，在碱裂解法裂解细胞的基础上，高效专一的结合质粒DNA。每次可处理5-15 mL菌液，获得多至100 μg转染级质粒DNA。使用特殊的去内毒素buffer ER，有效的去除内毒素、蛋白质等杂质。产品内另配备特殊指示剂CWBlue，保障质粒提取高效完成。
▪ 操作准确：加入颜色指示剂，保证操作的准确性，得到纯度高、质量稳定的质粒。
▪ 提取得率高：适用于5-15mL菌液，质粒得率可多至100μg，提高实验效率。
▪ 无内毒素：采用特殊的缓冲液系统和去内毒素Buffer，可获得转染级质粒。
▪ 适用范围广：适用于各种大小和高低拷贝数的目的质粒。
1. 适用于高拷贝/低拷贝质粒提取
【实验一】使用w66国际·利来无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)分别取7.5mL/15mL菌液提取高拷贝（p13）及低拷贝（PEGX）质粒，结果如下：
图1： M: DM10000 LaneA、B: A品牌质粒中提试剂盒 ; LaneC、D: w66国际·利来无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)
图2：M: DM10000 LaneA、B: A品牌质粒中提试剂盒 ; LaneC、D: w66国际·利来无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)
实验结果表明：w66国际·利来无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)应用范围广，适用于高拷贝/低拷贝质粒提取，得到的质粒纯度高，完整性好。
| 保存条件 | 运输条件 |
|---|---|
| RT（15-30℃） | 常温 |
若所提质粒拷贝数较低或大于10 kb的大质粒，可加大菌体使用量，同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer E3的用量保证菌体可以被完全裂解，洗脱缓冲液Endo-Free Buffer EB应在65℃-70 ℃水浴锅预热，同时在吸附和洗脱时可以适当地延长时间，以增加提取效率。
（1）质粒拷贝数：载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动，（每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的质粒载体产量为3-16 μg）。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg；
◇低拷贝质粒：pBR322, pACYC 及其衍生载体，pSC101 及其衍生载体，SuperCos, pWE15；
◇高拷贝质粒：pTZ, pUC, pBS, pGM-T；
（2）菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量；
（3） 细菌未充分裂解：细菌须在Buffer P1/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量；
（4） 试剂准备有误：Buffer P2和Buffer E3有沉淀析出，需37℃水浴几分钟至清亮方可使用（请勿剧烈晃动Buffer P2）；Buffer PW加入乙醇体积不准确（使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇）；
（5）将Endo-Free Buffer EB预热至65℃-70 ℃，并重复二次洗脱；
（6）培养时间过长或在 2-8℃保存时间过长会明显降低产量，建议使用新鲜的菌液。
37℃水浴混匀至澄清后使用，请勿剧烈晃动Buffer P2。
加入Buffer P2后应温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA。此
步骤所用时间应不超过5分钟，避免质粒受到破坏。
导致RNA污染，需补加RNase A至Buffer P1（终浓度200 μg/mL），混匀后2-8℃保存。
乙醇残留。Buffer PW 洗涤后应尽量离心去除残留的液体，待硅胶膜完全干燥后再加入洗脱缓冲液。
不可以，因为酵母是真菌，细胞壁比大肠杆菌（细菌）的更厚，因此使用CW2105S更难裂解，建议使用Yeast Plasmid Mini Kit（CW0509S ）提取。
可以。最好按照标准存放。
（1）储存温度不当或超出有效期：已加入RNase A的Buffer P1长时间室温放置可能会出现酶活下降，使用后应及时放回2 ~ 8℃。
（2）菌液体积过高：由于菌体数量过多，导致Buffer P1中RNase A不足以消化菌体中的RNA，建议减少菌液体积进行实验。
可以，该试剂盒提取的质粒纯度满足测序、PCR、酶切和转染等需求。
可以使用无菌无内毒素的核酸酶游离水（pH 7.0-8.5）从离心柱中洗脱DNA，以获得最佳洗脱效率。如需长期保存DNA，推荐使用试剂盒配套的DNA洗脱缓冲液。
在质粒条带上方出现的拖尾现象可能表明质粒提取物中存在基因组DNA污染。虽然这种情况并不常见，但基因组DNA可能在裂解过程中被剪切并与质粒共同纯化。加入Buffer P2后剧烈摇晃或涡旋可能会产生断裂的基因组DNA，应避免这种情况。如果裂解液非常粘稠且混合不均匀，建议减少实验使用的细胞起始量。
A260/280比值通过比较核酸最大吸收峰260nm与蛋白质最大吸收峰280nm的吸光度值，可评估所洗脱DNA的相对纯度。若中和反应不充分或洗涤步骤不完全，可能导致过量蛋白质残留在基质中并与DNA共同洗脱。
培养基成分和某些细胞成分会降低A260/A230比值。按照实验方案操作可确保去除这些污染物。此外，某些颗粒物可能与DNA一起洗脱，从而影响该比值。若出现这种情况，可在分光光度计（如Nanodrop®）检测前对洗脱的DNA进行额外15秒离心以沉淀颗粒物。
培养基成分和某些细胞成分会降低A260/A230比值。按照实验方案操作可确保去除这些污染物。此外，某些颗粒物可能与DNA一起洗脱，从而影响该比值。若出现这种情况，可在分光光度计（如Nanodrop®）检测前对洗脱的DNA进行额外15秒离心以沉淀颗粒物。
虽然Endo-Remover FM和Buffer ER能去除样品中绝大部分内毒素，但无法保证回收的DNA完全不含内毒素。需要说明的是，我们已成功使用该试剂盒回收的质粒DNA转染多种耐受性强的细胞系。尽管其他供应商可能宣称其小提试剂盒"无内毒素"，但通常仍可检测到微量内毒素存在。
为确保实验材料无内毒素污染，建议遵循以下操作规范：首选经认证的无热原/内毒素一次性塑料耗材（市售多种品牌可选），避免使用玻璃器皿—因其表面易吸附内毒素且常规清洗和高压灭菌均无法有效清除（若必须使用玻璃器皿，需180℃干热过夜处理）。特别注意曾接触细菌的灭菌锅会造成玻璃器皿二次污染。
可进行内毒素去除加强版的操作步骤。若Buffer ER出现沉淀，请于37℃加热至完全溶解并充分混匀后使用。加入ER缓冲液后需上下颠倒以确保充分混匀。
柱平衡是通过Buffer PS预处理吸附柱，目的是激活硅基质膜，提高其对质粒DNA的结合效率，从而提升最终产物的纯度和得率。
非必需，但建议添加以便监控裂解（变蓝色）和中和（无色+白色沉淀）效果。
Jian F, Wang J, Yisimayi A, Song W, Xu Y, Chen X, Niu X, Yang S, Yu Y, Wang P, Sun H, Yu L, Wang J, Wang Y, An R, Wang W, Ma M, Xiao T, Gu Q, Shao F, Wang Y, Shen Z, Jin R, Cao Y. Evolving antibody response to SARS-CoV-2 antigenic shift from XBB to JN.1. Nature. 2024 Nov 7. doi: 10.1038/s41586-024-08315-x. Epub ahead of print. PMID: 39510125.(IF:50.5)
Song X, Yang F, Yang T, et al. Phase separation of EB1 guides microtubule plus-end dynamics. Nat Cell Biol. 2023, 10.1038/s41556-022-01033-4. PMID: 36536176.(IF:17.3)
Li S, Yao Q, Li J, Yang H, Qian R, Zheng M, Wu N, Jiang H, Li L, Zeng Z. Inhibition of neutrophil swarming by type I interferon promotes intracellular bacterial evasion. Nat Commun. 2024 Oct 7;15(1):8663. doi: 10.1038/s41467-024-53060-4. PMID: 39375351; PMCID: PMC11458870.(IF:14.7)
Zhang Z, Leng XK, Zhai YY, et al. Deficiency of ASGR1 promotes liver injury by increasing GP73-mediated hepatic endoplasmic reticulum stress. Nat Commun. 204, 10.1038/s41467-024-46135-9. PMID: 38459023. (IF:14.7)
